Pruebas tempranas para la purificación de la enzima recombinante Acetilcolinesterasa (AChE) de las especies Varroa destructor y Apis mellifera, para el desarrollo de acaricidas de precisión

Abstract

La varroosis es la enfermedad de abejas melíferas más perjudicial y de mayor distribución geográfica en el mundo. La forma de controlarla, es con la aplicación en colmena de medicamentos como plaguicidas organofosforados. Sin embargo, el ácaro Varroa destructor se ha adaptado a varios de los componentes químicos de estos acaricidas tradicionales que tienen por objetivo inhibir la acción de enzimas relacionadas con procesos neurotransmisores, representando incrementos en las dosis de medicamentos que perjudican a distintas escalas, la supervivencia de las abejas y otros organismos que poseen las mismas enzimas. Ante esta resistencia se ha planteado la creación o re-diseño de inhibidores enzimáticos de la proteína Acetilcolinesterasa-AChE, para desarrollar acaricidas específicos y de alta precisión biológica contra la varroa.

Como parte inicial del proyecto, se plantea a través de este trabajo, el diseño, expresión y purificación de la AChE recombinante de Apis mellifera (AmAChE) y de Varroa destructor (VdAChE), para ello se amplificaron mediante PCR las secuencias nucleotídicas codificantes de la enzima de ambas especies en el plásmido de clonación pTwist Amp High copy. La expresión de la proteína más una cola de poli histidina, se consiguió trasnfectando células HEK 293-F con cada constructo. Posteriormente, los sobrenadantes con las proteínas se sometieron a 2 tipos de purificación: 1) Cromatografía por afinidad de un metal inmovilizado (IMAC) por lotes y con el sistema AKTA Start y 2) Cromatografía por intercambio iónico. La AmAChE posiblemente perdió su cola de poli histidina previo a los procesos de purificación, dificultando la IMAC, pero su punto isoeléctrico (PI) facilita futuras purificaciones por intercambio iónico. La VdAChE se purificó por IMAC e intercambio iónico y el grado de pureza obtenido permite continuar con la fase de ensayos de actividad enzimática, cambios en los protocolos y pruebas de inhibición enzimática específica.

Palabras clave: Plásmido, proteína recombinante, cromatografía, poli-histidina.